江苏丹阳人，生于丹徒(今镇江)，原名建常，改名良，晚号华封老人。出身于天主教家庭。早年受教会教育并研习中西文化与自然科学。同治九年(1870)获神学博士学位，担任神父。十一年任上海徐汇公学校长。光绪三年(1877)由其兄介绍任山东巡抚幕僚。七年任清政府驻日公使馆参赞，旋改任驻神户领事。二十九年在上海创办震旦学院，以“崇尚科学、注重文艺、不谈教理”为办学宗旨，以后又与严复创办复旦公学(复旦大学前身)。辛亥革命后曾代理北京大学校长并任总统府顾问、参政院参政等职务。1915年与英敛之共创辅仁学社(辅仁大学前身)。1917年以后归隐，从事译著天主教著作等活动。1931年九一八事变后，呼吁“朝野一心，武力抵抗”。1937年抗日战争爆发后任国民政府委员，上海沦陷迁居桂林，旋移往昆明，途中病逝于越南谅山。著有《致知浅说》、《国难言论集》等，后人编有《马相伯先生文集、续集》。